DH10bac感受态细胞
目录号：DH10Bac
保存条件 ：-80℃ ，至少6个月干冰运输 ，避免反复冻融（冻融之后的感受态不可再保存使用）
产品规格 ：10×100ul
产品介绍 ：大肠杆菌DH10 Bac感受态细胞是经特殊工艺制备的 ，适用于昆虫杆状病毒Bac-to-Bac系统中同源重组的菌株 ，用于产生重组Bacmid 。使用pUC19 质粒检测 ，转化效率可达107CFU/ug ，-70°C 保存几个月转化效率不发生改变 。DH10Bac菌株的基因型为 ：F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ (ara, leu)7697 galU galK λ- rpsL nupG /pMON14272 / pMON7124
DH10Bac细胞包含亲本Bacmid bMON14272和辅助质粒 pMON7124. 亲本Bacmid包含一个mini-F复制子 、卡那霉素抗性基因 、att Tn7位点和lac Zα-互补因子 。辅助质粒包含tns ABCD区域 ，该区域提供了mini-Tn7从供体质粒插入亲本Bacmid 靶位点所需要的转座蛋白 。供体如pFastBac系列质粒（pFastBac1 ，pFastBacDual等）含有Tn7R和Tn7L同源重组臂 ，Tn7R和Tn7L之间包含庆大霉素抗性基因 、昆虫病毒多角体基因启动子 、多克隆位点和SV40病毒的PolyA加尾信号 。当含有靶基因pFastBac的重组质粒转化到DH10Bac细胞后，发生重组后就可产生重组Bacmid ，提取纯化重组Bacmid转染昆虫细胞Sf9或Sf21就可以包装产生昆虫病毒 。此外 ，DH10Bac细胞中的The φ80dlacZDM15基因的产物可以实现β-半乳糖苷酶的α-互补现象 ，用于重组bacmid的蓝白斑筛选 。
操作方法 ：
1. 向1.5ml EP管管底加入500-1000ng连有目的基因的pFastBac系列质粒（100-200ng/μl的质粒约5μl） ；
2. 从-80oC冰箱中拿出感受态细胞 ，冰上解冻4-5min ，待刚解冻时，向EP管中加入100μl感受态细胞 ，立即放入冰上冰浴 。此步要轻柔快速地吸取 ，勿吹打 ，勿涡旋 ，若感受态细胞解冻过久未用 ，最好重新取一管使用 ；
3. 冰浴30min后 ，42oC热激45s。超净台内加入LB或SOC培养基900μl ，37oC ，200-220rpm/min ，培养4h ；
4. 1000×g离心10min后 ，倒掉部分上清 ，EP管内保留约200-300μl左右的上清液 ，用枪轻柔吹打重悬沉淀 ；
5. 吸取100μl重悬的菌液涂布到含有IPTG和X-gal的多抗平板上 ，37oC培养48h左右 。挑取最大 ，最白的菌斑 。
注意事项:
l 本步骤中所有试剂的用量均为本批次感受态细胞效价后获得 ，与官方说明书在某些细节上略有不同 ，仅适用于本批次DH10Bac感受态细胞。
l 本实验过程中涉及多次转化和重组反应 ，最终的转化效率受到很多因素影响 。平板上白斑较少且伴随很大比例的蓝斑属于正常现象 ，能挑到白斑即可 。并且在转化之前请确认质粒的纯度（A260/A280及A260/A230）处于良好的范围内 。并保证多抗平板内抗生素 ，IPTG和X-gal的浓度严格按照Bac-to-Bac官方说明书上配置 。
l 第五步中剩余的菌液最好保留 ，若发现斑较多 ，可以将剩余菌液复苏后稀释涂板 。若发现斑较少 ，可以复苏后再培养1-2h ，再离心重新涂布 。